2.1.5.7 臭氧消毒柜
2.1.5.7.1 目 的
測定臭氧消毒柜(下簡稱消毒柜)對物體表面上微生物的殺滅效果，以驗證其殺菌性能是否符合原設計規(guī)定。
2.1.5.7.2 試驗器材
(1) 金黃色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大腸桿菌( 8099 )、銅綠假單胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )懸液和脊髓灰質炎病毒懸液。
(2) 染菌載體(10mm × 10mm，以布片或玻璃片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。
(3) 臭氧采樣裝置和濃度分析儀。
(4) 細菌定量殺滅試驗用器材( 見 2.1.1.7，2.1.1.9 )。
(5) 脊髓灰質炎病毒滅活試驗用試液、培養(yǎng)基和器材(見 2.1.1.10 )。
(6) 溫度與濕度計。
2.1.5.7.3 臭氧濃度測定
(1) 儀器測定:臭氧濃度可用臭氧分析儀測定。操作按儀器使用說明書規(guī)定進行。
(2) 化學滴定法測定:參考本規(guī)范理化鑒定實驗技術。
2.1.5.7.4 殺滅微生物試驗操作程序
臭氧消毒柜的臭氧發(fā)生器臭氧發(fā)生量一般不可調，故試驗時設 3 個作用時間組［時間分組見2.1.1.7.3（1）］。
（1）細菌和真菌殺滅試驗
①按 2.1.1.2 所示相關方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設其他試驗微生物。
②因臭氧在柜內(nèi)擴散慢，分布不易均勻，故物品在柜內(nèi)應擺放至使用說明書中規(guī)定的最高裝載量(滿載)，以盡量接近實際應用時的情況。
③以 2 片菌片一組，置一無菌平皿中，勿重疊。試驗時，將放有菌片的平皿蓋打開，分層布放，每層內(nèi)、中、外各點分別放一組樣本。
④按照使用說明書要求，調節(jié)柜內(nèi)溫度與相對濕度，并記錄備查，然后開啟臭氧發(fā)生器進行消毒。
⑤消毒至規(guī)定時間，取出菌片，按 2.1.1.3 所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。對白色念珠菌的殺滅試驗，用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，對黑曲霉菌的殺滅試驗，用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基，其他方法和步驟均與細菌殺滅試驗相同。因臭氧氣體熏蒸，載體吸收的量少、分解快，可不必進行去除殘留臭氧的處理。每組試驗重復 3 次。
⑥將未消毒的菌片2片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，同時進行活菌培養(yǎng)計數(shù)檢測。取本次試驗同批的 PBS 接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為陰性對照。
[對未固定裝于消毒箱內(nèi)的臭氧發(fā)生器(如冰箱臭氧消毒器)，其殺菌效果鑒定，可按其用途，在相應的密閉柜內(nèi)進行。柜的大小應與所設計的殺菌有效范圍相近]。
（2）脊髓灰質炎病毒滅活試驗
①按 2.1.1.10.3 所示方法制備脊髓灰質炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。
②在消毒碗柜滿載的情況下，將干燥的染有脊髓灰質炎病毒的載體置滅菌平皿內(nèi)，每平皿放 2 片，勿重疊。在消毒碗柜每層的內(nèi)、外兩個點各放一含染有脊髓灰質炎病毒載體的平皿(大型碗柜可在內(nèi)、中、外各放一平皿)，平皿蓋打開。
③關閉柜門，開啟電源，按原規(guī)定程序進行消毒。消毒完畢，按說明書規(guī)定的時間，打開柜門，取出平皿。將載體移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質炎病毒滴度。
④將未消毒的染有脊髓灰質炎病毒的載體 2 片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，立即將載體移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質炎病毒滴度，作為陽性對照。
⑤陰性對照，用不含脊髓灰質炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。
⑥試驗重復 3 次。
⑦根據(jù)各組的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分別計算其對病毒的滅活對數(shù)值。
2.1.5.7.5 評價規(guī)定
對細菌及其芽孢和真菌，在3次試驗中，所設陽性對照組回收菌量在5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照無菌生長，試驗組中每次試驗細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3；對脊髓灰質炎病毒，在 3 次試驗中，所設陽性對照組，脊髓灰質炎病毒滴度達 105 (TCID50)，陰性對照細胞無污染，試驗組中每次試驗病毒滴度下降 4 個對數(shù)值者，該組作用時間可作為實驗室試驗消毒合格的最短作用時間。
若陽性或陰性對照組的結果與上述要求不符，試驗作廢，重新進行。
2.1.5.7.6 注意事項
(1) 對試驗結果有懷疑時，可在試驗時同步進行臭氧濃度測定，以便作進一步的分析。
(2) 每次試驗完畢，應充分排除消毒柜內(nèi)的臭氧氣體，勿使有臭氧殘留，以免影響隨后的試驗。
(3) 空氣中 臭氧 濃度不得超過 0.3mg/m3，臭氧吸入過多，可使人中毒，試驗場所應保持通風良好。
(4) 溫度和相對濕度均可影響臭氧氣體對細菌的殺滅效果，試驗時必須控制好這些條件，使其前后一致。
2.1.5.8臭氧水消毒器
2.1.5.8.1 目的
檢測臭氧水消毒器發(fā)生的臭氧水消毒劑對物品表面的消毒效果，以驗證臭氧水消毒劑對物品表面消毒的實用劑量。
臭氧水消毒劑指應用臭氧消毒設備制備的含臭氧的水溶液，并以其作為消毒劑，用于對物品表面等的消毒。
2.1.5.8.2 試驗器材
(1) 金黃色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大腸桿菌( 8099 )、銅綠假單胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )懸液和脊髓灰質炎病毒懸液。
(2) 染菌載體(10mm×10mm，以布片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。
(3) 臭氧采樣裝置。
(4) 細菌定量殺滅試驗用器材與培養(yǎng)基(見 2.1.1.7，2.1.1.9 )。
(5) 脊髓灰質炎病毒滅活試驗用試液、培養(yǎng)基和器材(見 2.1.1.10 )。
(6) 溫度與濕度計。
(7) 500 ml塑料杯。
(8) 水流量計（1L/min～10L/min）。
(9) 不銹鋼網(wǎng)。
(10) 臭氧濃度測定用臭氧分析儀和化學滴定法用試劑、器材等。
2.1.5.8.3 臭氧濃度測定
臭氧濃度的測定方法分為化學滴定法和儀器測定法。
儀器測定法按儀器使用說明書要求進行。
（1）通過式臭氧消毒設備
測定水樣流出消毒設備后臭氧濃度由高到低的衰變曲線。測定時，若出水流量可調，設 3 個流量其中應包括該設備的最大流量和最小流量，若出水流量不可調，則按說明書要求設 1 個流量，各流量水樣流出消毒設備后，即刻測定水樣中臭氧含量，然后再將水樣放 20℃ 水浴中，設 5個～6個時間段，分別測定水樣中臭氧含量，并繪制臭氧濃度衰變曲線。
（2）暴氣式臭氧消毒設備
測定一定容量的水體中臭氧濃度由低到高，直到臭氧濃度達飽和時的濃度變化曲線。按說明書要求，加入規(guī)定容量的水樣，通入臭氧氣體，設 5個～6個時間段（應測出臭氧濃度達飽和時的最短時間），分別測定水樣中臭氧含量，并繪制臭氧濃度變化曲線。
2.1.5.8.4 殺滅微生物試驗操作程序
按臭氧設備制備臭氧水消毒劑的方式分為暴氣式與通過式兩類。
（1）暴氣方式臭氧消毒設備制備臭氧水消毒劑的殺滅微生物試驗
①按 2.1.1.2 所示相關方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌黑色變種芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設其他試驗微生物。
②有專用容器者，按說明書要求向專用容器內(nèi)加入規(guī)定容量的無菌蒸餾水無專用容器者，用容量≥3000ml的燒杯，盛裝3000ml無菌蒸餾水樣，調水溫至20℃±2℃
若無專用容器但需在更大容量的水樣中進行試驗者，示消毒設備狀況，按使用說明書要求調整水樣用量，并調水溫至20℃±2℃。
③將不銹鋼網(wǎng)放盛水容器底部中央，染菌布片放不銹鋼網(wǎng)表面，染菌布片上再蓋一不銹鋼網(wǎng)片。
④連接微孔擴散裝置與臭氧氣源出口，開啟臭氧消毒設備，開始消毒處理。
⑤待臭氧暴氣浸泡消毒至規(guī)定作用時間（第一個作用時間應不少于水中臭氧達飽和濃度所需時間），取出樣片，移入含5 ml中和劑溶液的試管中，中和10 min，進行活菌計菌。
⑥試驗同時設陽性對照和陰性對照組，陽性對照用無臭氧氣體代替臭氧氣體，在水樣體積和暴氣量等相同條件下，將染菌樣片暴氣浸泡至最長作用時間，取出樣片，進行活菌計數(shù)。
⑦試驗重復3次。
⑧根據(jù)各組殺滅對數(shù)值計算結果，確定殺滅細菌繁殖體，真菌或細菌芽孢的殺滅對數(shù)值為3所需最低有效濃度和相應的作用時間。
（2）通過式臭氧消毒設備制備的臭氧水消毒劑流動載體浸泡殺滅微生物試驗
①按 2.1.1.2 所示相關方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌黑色變種芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設其他試驗微生物。
②將臭氧水消毒設備開機5min，使臭氧水中臭氧含量穩(wěn)定。
③取不銹鋼網(wǎng)放盛水容器底部中央，染菌布片放不銹鋼網(wǎng)表面，染菌布片上再蓋一不銹鋼網(wǎng)片。用臭氧水消毒劑沿容器壁流下，流動浸泡消毒至說明書規(guī)定作用時間，取樣檢驗。
④試驗同時設陽性和陰性對照。陽性對照組用自來水代替臭氧水消毒劑，在相同流量下流動浸泡至最長作用時間。取出樣片，進行活菌計數(shù)。
⑤取本次試驗同批的 PBS 和培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為陰性對照。
⑥試驗重復3次。
⑦根據(jù)各組殺滅率計算結果，確定殺滅細菌繁殖體、真菌或細菌芽孢的殺滅對數(shù)值為3所需最低有效濃度和相應的作用時間。
2.1.5.8.5 脊髓灰質炎病毒滅活試驗
(1) 按 2.1.1.10.3 所示方法制備脊髓灰質炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。
(2) 將制備的脊髓灰質炎病毒玻片加到無菌試管中，使帶有病毒的一面向上。
(3) 將臭氧水消毒設備開機5min，使臭氧水中臭氧含量穩(wěn)定。
(4) 向含有脊髓灰質炎病毒玻片的試管中加入1.0ml的臭氧水消毒劑，浸泡消毒至規(guī)定作用時間，取出玻片載體，移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質炎病毒滴度。
(5)將未消毒的染有脊髓灰質炎病毒的玻片，加到1.0ml的無菌蒸餾水中，浸泡至規(guī)定消毒作用的最長時間。取出玻片載體，移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質炎病毒滴度，作為陽性對照。
（6）陰性對照，用不含脊髓灰質炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。
(7) 試驗重復 3 次。
(8) 根據(jù)各組的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分別計算其對病毒的滅活對數(shù)值。
2.1.5.8.6 評價規(guī)定
對細菌及其芽孢和真菌，在3次試驗中，所設陽性對照組的回收菌量在5 × 105cfu/片～5 × 106 cfu/片，陰性對照無菌生長，試驗組中每次試驗細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3.00；對脊髓灰質炎病毒，在3次試驗中，所設陽性對照組，脊髓灰質炎病毒滴度達105 (TCID50)，陰性對照細胞無污染，試驗組中每次試驗病毒滴度下降4個對數(shù)值者，該組作用時間可作為實驗室試驗消毒合格的最短作用時間。
若陽性或陰性對照組的結果與上述要求不符，試驗作廢，重新進行。
2.1.5.8.7 注意事項
對試驗結果有懷疑時，可在試驗時同步進行臭氧濃度測定，以便作進一步的分析。
